پایان نامه دامپزشکی درباره بررسی عفونت ریوی مایکوپلاسمایی ناشی از مایکوپلاسما مایکوئیدس واریته مایکوئیدس و مایکوپلاسما کاپری کولوم واریته کاپری کولوم در گوساله‌ها و بزهای کشتارشده به روش PCR
با فرمت ورد (دانلود متن کامل پایان نامه)250 صفحه
فهرست
عنوان .......................... صفحه
الف- مقدمه.............................................. 1
ب-چکیده................................................. 3
فصلاول:کلیات..........................................5
1- تاریخچه..........................................
2- خصوصیات کلی مایکوپلاسما............................... 6
3- مقاومت مایکوپلاسماها................................. 8
4- طبقه بندی مایکوپلاسماها.............................. 9
5- طبقه بندی کلاستر مایکوئیدس........................... 12
6- فیلوژنی............................................. . 14
7- ساختمان ........................................... 15
1-7-ساختمان مایکوپلاسما مایکوئیدس ........................ 15
2-7- ساختمان مایکوپلاسما کاپری کولوم ................... 17
8- بیولوژی مولکولی..................................... 19
9- توالی‌های تکراری..................................... 23
10- پروتئینهای سطحی.................................... 25
11- فاکتور حدت......................................... 30
12- آنالیز پروتئین ................................... 32
13- طبقه بندی سویه‌ها .................................. 34
14- مشخصات گونه مایکوئیدس.............................. 35
15- کشت و رشد گونه مایکوئیدس .......................... 38
16- کشت و رشد گونه کاپری کولوم ........................ 41
1-16- محیط Thiacourt .................................... 41
17- بیماری پلوروپنومونی واگیر گاوان.................... 44
1-17- علائم بالینی ...................................... 45
2-17- علائم کالبدگشایی بیماری ........................... 47
3-17- پاتوژنز .......................................... 50
1-3-17- مکانیسمهای مقابله با دستگاه ایمنی............... 53
4-17- اختصاصیت میزبان................................... 57
5-17- انتقال بیماری ................................... 58
6-17- سیر همه گیری ..................................... 59
1-6-17- مخزن............................................ 59
2-6-17- راه انتقال...................................... 59
7-17- پیشگیری و کنترل................................... 60
1-7-17- اقدامات لازم برای حفاظت مناطق عاری از بیماری..... 61
2-7-17- اقدامات لازم هنگام شیوع بیماری................... 62
3-7-17- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومی................. 63
18- بیماری پلوروپنومونی واگیر بزان .................... 63
1-18- علائم بالینی ...................................... 64
2-18- علائم کالبد گشایی.................................. 66
19- گونه مایکوپلاسما کاپریکولوم کاپریکولوم.............. 69
1-19- سندروم MASKePs................................... 70
2-19- علائم بالینی....................................... 71
3-19- علائم کالبد گشایی.................................. 71
4-19- سندروم آگالاکتیه واگیر............................. 73
20- گونه مایکوپلاسما کاپری ............................. 73
1-20- بیماریزایی ....................................... 73
2-20- علائم کالبد گشایی.................................. 74
21- سیر همه‌گیری....................................... 75
1-21-مخزن............................................. .. 75
2-21-راه انتقال....................................... 76
3-21-جمعیت میزبان..................................... 77
22-پیشگیری وکنترل .................................... 77
1-22- اقدامات لازم برای محافظت مناطق عاری از بیماری.... 77
2-22- اقدامات لازم هنگام شیوع بیماری................... 78
3-22- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومی................. 78
23-واکسن................................................. 79
1-23-واکسن MmmLC .................................... 79
2-23-واکسن Mccp ....................................... 79
3-23-واکسن Mcc ....................................... 79 79-
اختصاصیت میزبان در کلاستر مایکوئیدس .................. ....... 80
25-تشخیص افتراقی...................................... 80
1-25-شناسایی عامل بیماری زا .......................... .. 81
1-1-25-بررسی میکروسکوپیک اگزودای ریه از طریق تهیه اسمیر یا برش بافتی 81
2-25- تشخیص آزمایشگاهی ............................... 81
1-2-25- روش کشت و جداسازی.............................. 81
1-1-2-25- انتخاب نمونه ها ................................ 82
2-1-2-25- آماده سازی نمونه ها ......................... 82
3-25- تستهای بیوشیمی.................................. 83
4-25- روشهای سرولوژی.................................. 85
1-4-25- عوامل موثر در آزمایشات سرولوژی .................. 85
2-4-25- تست مهاری رشد .................................. 87
3-4-25- تست ایمونو فلورسانس ............................. 88
4-4-25- تست رسوب ژلی................................... .. 88
5-4-25- تست فیکساسیون کامپلمان .......................... 89
6-4-25- تست ممانعت از هماگلوتیناسیون .................... 89
7-4-25- تست آگلوتیناسیون لاتکس.......................... 90
8-4-25- تست الیزای رقابتی.............................. 91
9-4-25- سایر تستهای تشخیصی............................. 94
5-25 - مشکلات روشهای سنتی.............................. 94
6-25- تشخیص با استفاده از PCR......................... 95
فصل دوم: روش کار
26- روش کار .......................................... 101
1-26- جمع آوری نمونه .................................... 101
1-1-26- مواد لازم......................................... 101
2-1-26- بخش جمع آوری نمونه............................. 101
3-1-26- نمونه برداری .................................. 103
2-26- کشت و جداسازی نمونه ها........................... 104
1-2-26- مواد لازم ...................................... 104
2-2-26- طرز تهیه محیط کشت اختصاصی برای جداسازی مایکوپلاسمای نشخوار کنندگان 106
1-2-2-26- مواد لازم .................................... 106
2-2-2-26- روش تهیه محیط کشت............................... 107
3-26- استخراج DNA مایکوپلاسما.......................... 109
1-3-26- روش استخراج DNA از نمونه های ارسالی.............. 109
4-26- فرایند PCR ..................................... 110
1-4-26- مواد لازم ...................................... 110
2-4-26- آماده سازی مواد جهت واکنش PCR ................... 112
1-2-4-26- افزوده سازی DNA نمونه‌ها .................... 112
2-2-4-26- افزوده سازی DNA کلونیهای جدا شده............ 115
3-2-4-26- تهیه مخلوط اصلی اولیه........................ 115
3-4-26- پرایمرها....................................... 115
4-26- واکنش PCR....................................... 117
5-26- تهیه ژل الکتروفورز ............................. 118
1-5-26- طرز تهیه محلول اتیدیوم برماید ................... 119
6-26- الکتروفورز ........................................ 121
7-26- رویت باندهای ایجاد شده ......................... 122
فصل سوم: نتایج
27- نتایج ............................................ .. 124
1-27- جداسازی......................................... 124
1-1-27- بررسی عملکرد محیط کشت.......................... 124
2-1-27- نتایج کشت نمونه های ارسالی .................... 124
1-2-1-27- نتایج روز پنجم ............................. 125
2-2-1-27- نتایج روزهفتم تا دهم......................... 125
3-2-1-27- نتایج روزپانزدهم............................. 126
2-27- نتایج PCR ....................................... 126
1-2-27- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر جنس ............ 126
2-2-27- تائید کلونی های جدا شده........................ 127
3-2-27- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر کلاستر مایکوئیدس. 127
4-2-27- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر گونه آگالاکتیه... 128
5-2-27- نتایج PCR نمونه ها با پرایمر گونه مایکوئیدس کلونی بزرگ 129
3-27- نتایج کالبد گشایی............................... 130
1-3-27- معیار انتخاب .................................. 130
فصل چهارم: بررسی نتایج
نمودارها................................................. 131
فصل پنجم: بحث
28- بحث ................................................. 139
1-28- ضایعات کالبد گشایی................................. 139
2-28- میزان وقوع عفونت تنفسی مایکوپلاسما .............. 141
3-28- روش کشت......................................... 142
4-28- روش PCR ....................................... 147
5-28- فراوانی گونه ها ................................ 152
29- خلاصه انگلیسی...................................... 159
30- منابع ............................................ .. 160
مقدمه
عفونت پلوروپنومونی واگیر، بیماری تحلیل برنده تنفسی است که با جای گرفتن در طبقه‌بندی بیماریهای سازمان جهانی کنترل بیماریهای واگیر، لزوم و اهمیت شناسایی آن مشخص شده است. عامل اصلی این بیماری، گونه مایکوپلاسما مایکوئیدس میباشد که تایپ کلونی کوچک آن[1] بطور اختصاصی به گله‌های گاو، خسارات فراوانی ناشی از همه‌گیری گسترده و مرگ و میر فراوان تحمیل کرده است.
تایپ کلونی بزرگ این گونه[2] همراه با دو گونه دیگر بنامهای مایکوپلاسما کاپری کولوم کاپری کولوم[3] و مایکوپلاسما مایکوئیدس کاپری[4] فرم غیرکلاسیک پلوروپنومونی واگیر را در گله‌های گوسفند و بز بوجود آورده‌اند. این بیماری در فرم کلاسیک، که عامل آن مایکوپلاسما کاپری کولوم کاپری پنومونی[5] شناخته می‌شود، خسارات اقتصادی سهمگینی در گله‌های بز و گوسفند موجب گردیده است.
از آنجائیکه منطقه خاورمیانه جزو مناطق مشکوک به آلودگی پلوروپنومونی واگیر محسوب می‌شود، حفظ وضعیت عاری بودن از عفونت در این منطقه، مشکل یا تقریبا غیرممکن بوده و نیازمند بازنگری درراهبردهای بکار رفته به منظور تشخیص و کنترل این عفونت‌هاست. عدم برخورداری از خصوصیت پاتوگونومیک تشخیصی و پاتولوژیکی، مسیر بیماریزایی ناشناخته و تنوع فنوتیپی بسیار پیچیده ارگانیسم در مواجهه با دستگاه ایمنی میزبان، بر مشکل شناسایی آن افزوده است. علاوه بر این ، ابقا طولانی مدت باکتری در محل عفونت و وجود ناقلین بدون علامت، برنامه کنترل بیماری را با چالش روبرو کرده است.
از این رو، شناسایی و بکارگیری روشهای تشخیصی و تفریقی گونه‌های کلاستر مایکوپلاسما مایکوئیدس که هرکدام استراتژی جداگانه ای در برخورد با عفونت گله‌ها دارند، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است.
از آنجایی که مایکوپلاسماهای پاتوژن در محیط کشت به سختی رشد می‌کنند، استفاده متداول از روش کشت و جداسازی، شناسایی عفونت گله‌ها را با مشکل روبرو کرده است.
از طرف دیگر، عمدتا به دلیل تشابه آنتی ژنتیکی بین گونه‌های کلاستر مایکوئیدس و سایر گونه‌های مایکوپلاسما، روشهای سرولوژی از دقت و ویژگی کافی در تمایز گونه‌ها برخوردار نیستند. لذا به رهیافت روشهای مولکولی مانندPCR بعنوان روشی سریع، دقیق و با حساسیت و ویژگی مطلوب در کنترل عفونت گله‌ها، توجه ویژه‌ای می‌شود.
هدف از این مطالعه، بررسی عفونتهای تنفسی ناشی از کلاستر مایکوئیدس در گله‌های نشخوارکنندگان از طریق کشت و PCR میباشد.
چکیده :
کلاستر مایکوپلاسما مایکوئیدس در برگیرنده مهمترین پاتوژنهای تنفسی نشخوارکنندگان است که سالیانه، خسارات اقتصادی سنگینی بر صنعت دامپروری کشورهای جهان وارد می‌کند. اخیرا شیوعهای بازپدیدی از عفونتهای پلوروپنومونی نشخوارکنندگان در منطقه خاورمیانه گزارش شده است. در این شرایط تعیین وضعیت گله‌های کشور از نظر آلودگی به گونه‌های پاتوژن این کلاستر، از اهمیت خاصی برخوردار است. هنوز گزارشی از شناسایی و جداسازی گونه‌های درگیر از عفونت پلوروپنومونی در ایران بدست نیامده است. عدم برخورداری از خصوصیت پاتوگونومیک در نمونه‌های بالینی و دشواریهای فراوان جداسازی میکروارگانیسم، به ضرورت شناسایی و بکارگیری روشهای تشخیصی جایگزین افزوده است.
علاوه بر این، دستیابی به روشی کاربردی و سریع، در تشخیص عفونتهای تنفسی گله‌ها و تخمینی از وضعیت عفونت در ایران، مدنظر این تحقیق بوده است.
در این مطالعه، 100 نمونه ریه با ضایعات مشکوک به عفونتهای تنفسی مایکوپلاسمایی از 100 گله مشکوک (50 گله گاو،30 گله گوسفند،20 گله بز) در اطراف کرمانشاه ، در سالهای 1386-1384 جمع آوری شدند. ضایعات ماکروسکوپی شامل کبدی شدن ریه‌ها با زخم‌های خاکستری و سفید(جامد شدن) و ظاهر منقوط با یا بدون فیبرین بودند. نمونه‌ها در محیط کشت PPLO براث و آگار کشت داده شدند. پس از پاساژهای متعدد،از 23 گله مشکوک،تک کلونی تخم‌مرغی شکل مایکوپلاسما جداشد(11 گله گاو،8 گله گوسفند،4 گله بز).
اما در واکنش, PCR63 گله عفونت مایکوپلاسمای تنفسی نشان دادند (37 گله گاو، 17 گله گوسفند، 9 گله بز).
این امر، مبین این نکته است که علیرغم اینکه جداشدن عامل مایکوپلاسمایی از نمونه‌ها در محیط کشت، اساس تعیین وضعیت عفونتهای مایکوپلاسمایی قلمداد می‌شود، اما سخت‌رشد بودن گونه‌های مورد مطالعه در محیط کشت و عدم دستیابی سریع به نتیجه، کارآیی این روش تشخیصی را در پایش متداول عفونت گله‌ها زیر سوال برده است.
علاوه بر این، بکاربردن آنتی بیوتیکهای متنوع در دوره درمان و از بین رفتن میکروارگانیسم در خلال جمع آوری نمونه، نتایج رشد در محیط کشت مایکوپلاسما را دستخوش تغییر داده است.
از این رو، استفاده از روشهای مولکولی PCR بعنوان یک روش کاربردی، حساس و سریع توصیه می‌شود. پس از استخراج DNA نمونه‌ها به روش فنل کلروفورم و جدا کردن نمونه‌های آلوده به مایکوپلاسما از طریق PCR ، با استفاده از پرایمر اختصاصی کلاستر مایکوئیدس نمونه‌های مایکوپلاسمایی تحت واکنش PCR قرار گرفتند.
باند bp 548، تنها در نمونه کنترل ( سویه F38) دیده شد. به منظور کنترل روند واکنش، نمونه‌ها با پرایمر اختصاصی مایکوئیدس کلونی بزرگ و پرایمر اختصاصی آگالاکتیه، به طور جداگانه PCR شدند که نتیجه این آزمایش، یافته‌های آزمایش قبلی را تائید می‌کرد.
اگر چه این تحقیق نشان داد که عامل عفونتهای تنفسی مشکوک در نمونه‌های مورد مطالعه نمی‌تواند از گونه‌های کلاستر مایکوئیدس باشد، منتهی تخمین میزان عفونت در گله‌های مورد مطالعه، احتیاج به تحقیقات وسیعتر با جمع‌آوری تعداد نمونه‌های بیشتر در مطالعات بعدی دارد.
عنوان پایان نامه : عفونت پلوروپنومونی